Методики выделения клеток

ВИРУС ГЕПАТИТА D, BГD (Hepatitis Delta virus, HDV) - возбудитель гепатита D (Дельта гепатита ). BГD не принадлежит ни к одному из известных семейств вирусов животных. По своим свойствам BГD наиболее близок к вироидам и сателлитньм вирусам растений. В 1977 г. итальянский исследователь М. Риссетто при помощи метода флюоресцирующих антител обнаружил в гепатоцитах больных хроническим гепатитом В антиген, отличный от антигенов вируса гепатита В . Выявленный антиген был назван дельта-антигеном. Эксперименты по заражению шимпанзе материалом, содержащим дельта-антиген, продемонстрировали, что он является частью трансмиссивного агента (дельта-агента или BГD), вызывающего гепатит, отличный от других вирусных гепатитов.

BГD — сферическая частица со средним диаметром 36 нм (с колебаниями от 28 до 39 нм), состоящая из ядра (HDAg) и внешней оболочки, образованной поверхностным антигеном вируса В . Плавучая плотность в градиенте CsCI — 1,25 /см3 . Морфологически частицы BГD, циркулирующие в крови больных дельта-гепатитом или носителей BГD, сходны с частицами Дейна, но с менее четко очерченным ядерным антигеном.

Геном BГD представлен однонитевой, циклической молекулой РНК, состоящей приблизительно из 1700 нуклеотидов. В BГD, циркулирующем в крови больных острой или хронической дельта-инфекцией, РНК BГD образует палочковидную неразветвленную структуру. Характер плотной упаковки генома определяется высокой степенью комплиментарности нуклеотидов, входящих в его состав. Причем, сочетание пар оснований гуанин-цитозин, составляет до 60%. Анализ нуклеотидных последовательностей РНК BГD нескольких изолятов вируса выявил их частичную гетерогенность (от 72,1% до 92,0% гомологии). В геноме BГD имеется несколько открытых рамок считывания, как на геномных, так и на антигеномных нитях РНК. Причем, в отличие от вироидов и сателлитных вирусов растений в РНК закодирован вирусспецифический полипептид - HDAg (пятая открытая рамка считывания, локализованная на комплементарной зоне РНК BГD).

Выявлено две разновидности HDAg с молекулярными массами в 24 и 27 кД. На их поверхности расположен общий эпитоп, определяемый при помощи моноклональных антител человеческого происхождения. Считается, что малая форма HDAg необходима для репликации BГD, а большая для постройки вирусной частицы. Дельта-антиген локализуется в ядрах инфицированных гепатоцитов, в ядрышках и/или нуклеоплазме.

HDAg имеет выраженную РНК-связывающую активность. Связывание происходит благодаря узнаванию антигеномной уникальной вторичной структуры РНК BГD, что определяет строгую специфичность связывания и объясняет отсутствие взаимодействия с другими вирусными и клеточными РНК. При нагревании BГD происходит укрепление связи HDAg с РНК, которая становится устойчивой к действию мочевины, гуанидина или меркаптоэтанола. Дельта-антиген устойчив к нагреванию, действию кислот и нуклеаз, но разрушается в присутствии щелочей и протеаз. Он обладает антигенной активностью и может быть использован для конструирования диагностических препаратов.

Механизм прикрепления, проникновения и раздевания BГD в клетках мало изучен. Вместе с тем считается, что HBsAg, покрывающий дельта-антиген, кодированный S-геном вируса гепатита В (включая pre-SI, pre-S2 и S-зону),необходим для прикрепления BГD к поверхности гепатоцита. При этом в отличие от частиц Дейна, в которых HBsAg представлен частицами с pre-Sl, pre-S2 и S-пептидами в соотношении 1:1:4, в дельта-вирусе это соотношение составляет 1:5:95.

Инфицированные гепатоциты содержат как геномные (+), так и антигеномные (-) молекулы РНК BГD в соотношении 5-30:1. РНК BГD представлена линейными и циклическими формами. Общее количество молекул РНК BГD может достигать 100000-300000 копий в одной клетке.

Репликация РНК BГD происходит в ядре зараженного гепатоцита; по аналогии с вироидами она может быть описана следующим образом: на кольцевой молекуле геномной РНК (+) при помощи клеточного фермента (возможно ДНК-зависимой РНК-полимеразы II) синтезируется комплиментарная (-) цепь РНК. Синтез нуклеиновой кислоты осуществляется согласно модели раскручивающегося кольца с вытеснением 5' конца РНК с последующим синтезом плюс-цепи. Возможно, антигеномные нити РНК сворачиваются в кольцо с последующим синтезом геномных РНК BГD. Расщепление линейных олигомерных структур РНК осуществляется при помощи клеточных ферментов. Процесс РНК РНК копирования может происходить по симметричному и асимметричному пути.

Вопросы, связанные с транскрипцией и трансляцией гена, кодирующего HDAg, до сих пор полностью не решены. Имеется скудная информация и о таких этапах морфогенеза, как сборка и выход вируса из гепатоцита.

Вирус гепатита D не может участвовать в развитии гепатитной инфекции без одновременной репликации вируса гепатита В. Этот факт определяет две возможные формы их взаимодействия: одновременного инфицирования ВГВ и BГD - коинфекция и инфицирования ВГD носителя вируса гепатита В — суперинфекция. Характер взаимосвязи этих вирусов определяется не только использованием HBsAg для формирования внешней оболочки BГD, но и другими, до конца непонятными взаимодействиями. Так, BГD ингибирует репликацию ВГВ, приводя к уменьшению экспрессии HBcAg и HBsAg и угнетению активности ДНК-полимеразной активности в течение острой инфекции. Одним из возможных объяснений этого факта являются данные о стимуляции дельта-вирусом внутриклеточного синтеза интерферона , который вызывает ингибицию репликации ВГВ.

Последнее время получены экспериментальные данные, что дельта-вирус может размножаться в организме приматов и без участия вируса гепатита В, но при этом никаких повреждений не наблюдается. Предположительно наружная оболочка дельта-вируса формируется из клеточных белков, вследствие чего его обнаружение затруднено.

Анализ инфекционной активности дельта-вируса показал, что она приблизительно на пять порядков ниже по сравнению с ВГВ. Инфицирование дельта-вирусом может вызвать острое заболевание, заканчивающееся выздоровлением или формированием хронического носительства BГD. Экспериментальное заражение дельта-вирусом человекообразных обезьян-носителей HBsAg и сурков-носителей вируса гепатита сурков вызывает острую суперинфекцию. При этом через 2 недели после заражения в гепатоцитах животных удается идентифицировать дельта-антиген, который по своим физико-химическим и иммуногенным свойствам идентичен дельта-антигену из гепатоцитов больного человека. Полученный при экспериментальной дельта-вирусной инфекции у сурков дельта-антиген с успехом используется для приготовления коммерческих диагностических препаратов, применяющихся для выявления серологических маркеров дельта-инфекции у людей.

Дельта-вирусную инфекцию удалось также воспроизвести и при заражении дельта-вирусом пекинских уток-носителей вируса гепатита пекинских уток.

Дельта-вирус может быть обнаружен в гепатоцитах и в крови больных острой и хронической дельта-инфекцией. Применение иммуноэлектронной микроскопии, при которой используются антитела к HBsAg, позволяет изучать морфологию дельта-вируса. Маркерами, свидетельствующими о наличии дельта-вируса в исследуемом материале, служат дельта-антиген и/или PHK BГD.

Для обнаружения дельта-антигена в биопсийном или аутопсийном материале применяют метод флюоресцирующих антител и иммунопероксидазные методы, когда комплекс дельта-антигена и антител к нему, меченных пероксидазой хрена, визуализируют при помощи гистохимической реакции на пероксидазу.

В сыворотке крови дельта-антиген определяют при помощи иммуноферментного или радиоиммунного анализа лишь только после того, как исследуемый материал обрабатывается неионными детергентами (твин, тритон и др. ), разрушающими наружную оболочку вируса, тем самым делая доступными антигенные детерминанты HDAg.

Детекцию РНК BГD проводят при помощи кДНК-гибридизации с зондами, полученными генноинженерным путем, или же методом амплификации кДНК ВГD , позволяющим выявлять до 103 молекул РНК BГD.

Культивирование BГD в клеточных линиях, в том числе печеночного происхождения с интегрированным геномом ВГВ, до сих пор были неудачны. Вместе с тем, описаны эксперименты по продукции BГD в линии клеток гепатомы человека (HUH-7) и почек мартышек (COS7) после их трансфекции РНК ВГD.